การควบคุมคุณภาพผลการทดสอบสำหรับห้องปฏิบัติการ

การประกันคุณภาพผลการทดสอบ คือ แผนและการดำเนินการอย่างมีระบบที่จำเป็นให้ได้มาซึ่งความเชื่อมั่นที่เพียงพอว่าการบริการเป็นไปตามข้อกำหนดด้านคุณภาพ และตามข้อกำหนดของ ISO/IEC17025 ซึ่งกำหนดเรื่องการประกันคุณภาพ ผลการทดสอบ/สอบเทียบ โดยมีองค&ประกอบของการประกันคุณภาพการทดสอบประกอบไปด้วย การควบคุมคุณภาพ (Quality Control: QC) และการประเมินคุณภาพ (Quality Assessment: QA) ซึ่งมีความสำคัญในแง่ของความแม่นและความเที่ยงของผลการทดสอบที่เกี่ยวข้องกับทางด้านกฎหมาย การดำเนินคดี อ้างอิง ฟ้องร้อง เป็นต้น

การควบคุมคุณภาพ หมายถึง การดำเนินการและกิจกรรมทางวิชาการ ที่นำมาใช้เพื่อให้ตรงตามข้อกำหนดด้านคุณภาพ ซึ่งแบ่งออกเป็น 2 ชนิด ได้แก่ การควบคุมคุณภาพภายใน (Internal Quality Control; IQC) และ การควบคุมคุณภาพภายนอก (External Quality Control) เช่น การเข้าร่วมโปรแกรมการทดสอบความชำนาญของห้องปฏิบัติการ โดยการเปรียบเทียบผลการทดสอบระหว่างห้องปฏิบัติการ การควบคุมคุณภาพภายใน

การควบคุมคุณภาพภายใน (Internal Quality Control; IQC) เป็นกระบวนการที่ใช้ในการตรวจสอบการตรวจวิเคราะห์ตัวอย่างของห้องปฏิบัติการ เพื่อควบคุมคุณภาพผลการวิเคราะห์ เฝ้าระวังการทดสอบ การถ่ายโอนข้อมูล การสุ่มตัวอย่าง การเตรียมตัวอย่าง ตลอดจนการรายงานผลการวิเคราะห์ และรักษาไว้ซึ่งคุณภาพผลการวิเคราะห์ และปรับปรุงการปฏิบัติงานในแต่ละขั้นตอน เพื่อให้ได้มาซึ่งผลการวิเคราะห์ที่ถูกต้อง น่าเชื่อถือตลอดจนการให้บริการที่มีประสิทธิภาพที่ดีตลอดเวลา ซึ่งแผนควบคุมคุณภาพในห้องปฏิบัติการ ประกอบด้วยแนวทางดังต่อไปนี้ และห้องปฏิบัติการสามารถเลือกใช้เป็นแนวทางควบคุมคุณภาพภายในได้ตามความเหมาะสมของแต่ละห้องปฏิบัติการ

การตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีทดสอบ (validation of analytical method หรือ method validation)
การทวนสอบวิธี (method verification)
การควบคุมคุณภาพสม่ำเสมอ (routine qaulity control)

1. การทดสอบแบลงค์ของสารเคมี (Reagent Blank)

เป็นการประเมินการปนเปื้อนที่อาจจะเกิดขึ้นจากสารเคมี และตรวจสอบความบริสุทธิ์ของสารเคมีที่ใช้ และการทดสอบแบลงค์ของวิธีวิเคราะห์ (Method Blank) เป็นการตรวจสอบการปนเปื้อนที่อาจจะเกิดขึ้น ระหว่างการเตรียมตัวอย่างโดยการทดสอบ reagent blank หรือ method blank จะเตรียมพร้อมกับตัวอย่าง โดยไม่มีตัวอย่าง ดำเนินการเมื่อเริ่มการทดสอบ และคั่นระหว่างการทดสอบหรือตามความเหมาะสม ทั้งนี้ผลการทดสอบแบลงค์ ไม่ควรพบสารที่ต้องการทดสอบ หรือรบกวนได้ในระดับที่ไม่รบกวนผลทดสอบตัวอย่าง หากพบสารในแบลงค์ในระดับที่มีผลกระทบต่อการทดสอบ ต้องหาสาเหตุ แก้ไข และทดสอบใหม่ทั้งหมด

2. การทดสอบสารมาตรฐาน (Calibration Standard)

เป็นการยืนยันความถูกต้องกราฟมาตรฐาน โดยการเตรียมสารมาตรฐานที่ทราบความเข้มข้น และวัดสารมาตรฐานหลังจากทำกราฟมาตรฐานแล้วทำการสร้างกราฟมาตรฐานโดยใช้ Standard 3 – 5 ความเข้มข้น หรือมากกว่า เพื่อพิสูจน์ความเป็นเส้นตรง linear range โดยดูจากค่าสัมประสิทธิสหสัมพันธ์ (correlation coefficient, r) หรือสัมประสิทธิ์การตัดสินใจ (coefficient of determination, R²) จากค่า r หรือ R² โดยทั่วไปเกณฑ์การยอมรับ : r = 0.995, R² = 0.990

3. ทำการวิเคราะห์สารมาตรฐานที่ได้รับการรับรอง (Certified Reference Materials; CRM)

Certified Reference Materials เป็นวัสดุหรือสารอ้างอิงมาตรฐานที่ได้รับการรับรอง โดยการดำเนินการที่ถูกต้องตามหลักวิชาการ มีใบรับรอง และสามารถสอบกลับ (traceability) ไปยังมาตรฐานระหว่างประเทศ (International Standard, SI unit) ได้ การวิเคราะห์ CRM เพื่อเป็นการทวนสอบให้มั่นใจว่าค่าที่ได้จากการวิเคราะห์ตัวอย่างควบคุมต่าง ๆ มีความถูกต้อง จึงควรวิเคราะห์ CRM อย่างต่อเนื่อง โดยเลือก CRM ที่มีความเข้มข้นใกล้เคียงกับตัวอย่าง เกณฑ์ยอมรับ : ±10% ของค่าจริง (true value) หรือใช้ t-test หรือพิจารณาจาก % ความถูกต้อง

%ความแม่น = (ค่าที่วิเคราะห์ได้/ค่าจริง) x 100

Link >> CRM คืออะไร

4. การวิเคราะห์ซ้ำ (Duplicates)

เป็นการประเมินความแม่นยำของการวิเคราะห์ โดยทำซ้ำในทุกๆ 10% หรือตามความถี่ที่เหมาะสม
เป็นการวิเคราะห์ตัวอย่างสองซ้ำ ในแต่ละชุดตัวอย่าง (Batch) ซึ่งเป็นการตรวจสอบความเที่ยงตรง โดยเกณฑ์ยอมรับของ % ความแตกต่างสัมพัทธ์ (% Relative Percent Difference, RPD) ซึ่งหลักการคำนวณประกอบด้วย

5. การวิเคราะห์การคืนกลับของสาร (% Recovery)

เป็นการตรวจสอบความแม่นของการวิเคราะห์ตัวอย่างที่มีองค์ประกอบที่ซับซ้อน (matrix effect) โดยทดสอบที่ความเข้มข้นต่าง ๆ ตลอดช่วงใช้งาน (working range) โดยทำการเติมสารมาตรฐานความเข้มข้นสูง ๆ แต่ปริมาณน้อย ๆ ลงในตัวอย่าง เพื่อตรวจสอบการกลับคืนของสารที่สนใจ (analyte recovery) หรือตรวจสอบผลการรบกวนจากเมทริกซ์ของตัวอย่าง โดยสารมาตรฐานที่นำมาเติมควรมาจากคนละแหล่งกับที่ใช้เตรียมกราฟมาตรฐานความเข้มข้น (calibration curve) (ถ้าทำได้) และความเข้มข้นของ spiked sample ควรอยู่ในช่วงเดียวกับตัวอย่างที่นำมาวิเคราะห์ ทั้งนี้ผู้วิเคราะห์ ควรแนใจว่าสิ่งที่เติมลงไปมีคุณสมบัติทางเคมีเหมือนตัวอย่างและรวมตัวเป็นเนื้อเดียวกับตัวอย่าง หลักการคือเติมสารที่ทดสอบซึ่งทราบปริมาณลงในตัวอย่าง (spiked sample) ทดสอบตัวอย่างและคำนวณค่าคืนกลับในรูปร้อยละการกลับคืน (%recovery)

ผู้วิเคราะห์ทดสอบสามารถทำการวิเคราะห์ matrix spiked sample โดยใช้ความเข้มข้นประมาณ 10 เท่าของขีดจำกัดต่ำสุดของวิธีทดสอบ หรือเท่ากับความเข้มข้นที่จุดกึ่งกลางของความเข้มข้นของช่วงใช้งานหรือตามข้อมูลของการตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีทดสอบ (method validation) ทั้งนี้ เกณฑ์ยอมรับ %recovery สามารถอ้างอิงได้จากข้อมูลการตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีทดสอบ หรือจากแหล่งอ้างอิงต่างๆ ที่ยอมรับในระดับสากล ทั้งจาก AOAC , Codex เป็นต้น

ตารางที่ 1 เกณฑ์ยอมรับ %recovery อ้างอิงตาม Codex, 2010

ความเข้มข้น	อัตราส่วน	หน่วย	%recovery
100	1	100 (10 g/100 g)	98-102
≥10	10^-1	≥10 (10 g/100 g)	98-102
≥1	10^-2	≥1 (1 g/100 g)	97-103
≥0.1	10^-3	≥0.1 (0.1 g/100 g)	95-105
0.01	10^-4	100 mg/kg	90-107
0.001	10^-5	10 mg/kg	80-110
0.0001	10^-6	1 mg/kg	80-110
0.00001	10^-7	100 μg/kg	80-110
0.000001	10^-8	10 μg/kg	60-115
0.0000001	10^-9	1 μg/kg	40-120

ตารางที่ 2 เกณฑ์ยอมรับ %recovery สำหรับสารเดี่ยว (AOAC. 2002)

ความเข้มข้น	%recovery
100%	98-101
10%	95-102
1%	92-105
0.1%	90-108
0.01%	85-110
10 μg/g	80-115
1 μg/g	75-120
10 μg/kg	70-125

ตารางที่ 3 เกณฑ์ยอมรับ %recovery สำหรับสารผสม (AOAC. 2002)

ความเข้มข้น	%recovery
≤1-10 μg/kg	50-120
>1-10 μg/kg	60-120
>10-100 μg/kg	70-120
>100 μg/kg	70-110

6. การทดสอบผลลบควบคุม (Negative control)

เป็นการทดสอบตัวอย่างโดยในแต่ละชุดการทดสอบ ต้องมีตัวอย่างควบคุมเพื่อคัดกรอง ได้แก่ “ตัวอย่างควบคุมผลลบ” คือใช้ตัวอย่าง/เนื้อเยื่อปลอดสาร (blank matrix) ซึ่งเป็นตัวอย่างที่เคยตรวจสอบและแสดงผลลบ

7. การเปรียบเทียบผลการทดสอบระหว่างนักวิเคราะห์ภายในหน่วยงาน

ใช้ในกรณีที่ต้องการเปรียบเทียบผลระหว่างผู้ทดสอบ 2 คนขึ้นไป ทดสอบตัวอย่างเดียวกัน โดยอาจเป็นตัวอย่างที่เคยทดสอบแล้วและมีผลการทดสอบเดิม ทั้งนี้ กรณีทราบค่าจริงหรือมีผลการทดสอบเดิม เปรียบเทียบค่าทดสอบของผู้ทดสอบแต่ละคนกับค่าจริง หรือกับผลการทดสอบเดิม โดยใช้สถิติ t-test แบบ one tail หรือสถิติอื่นที่เหมาะสม

นอกจากนี้ เพื่อควบคุมการวิเคราะห์ให้ได้ผลการวิเคราะห์ที่มีเสถียรภาพในขอบเขตที่ยอมรับได้ที่ใช้ในห้องปฏิบัติการอีกแนวทางหนึ่ง คือการทำแผนภูมิควบคุม (Control Chart) ซึ่งแผนภูมิควบคุม เป็นเครื่องมือทางสถิติที่ใช้ในการควบคุมความผันแปรของกระบวนการในแต่ละขั้นตอน เพื่อให้มั่นใจว่า ทุกๆ กระบวนการวิเคราะห์อยู่ในความควบคุม และสามารถดำเนินการซ้ำ ๆ กันได้โดยให้ผลอยู่ในช่วงที่ต้องการ นั่นหมายถึงกระบวนการยังมีความสามารถหรือยังใช้ได้ถูกต้องอยู่นั่นเอง และสืบเนื่องจากการจัดทำระบบประกันคุณภาพ
ห้องปฏิบัติการ ISO/IEC17025 ห้องปฏิบัติการจึงจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องทำแผนภูมิควบคุม ในกระบวนการต่างๆ เพื่อเฝ้าระวัง และตรวจสอบระบบการควบคุมคุณภาพดังกล่าวของห้องปฏิบัติการให้มีประสิทธิภาพอยู่สม่ำเสมอ

หลักการทำแผนภูมิควบคุม (Control chart) มีหลากหลายแนวทางขึ้นอยู่กับห้องปฏิบัติเลือกใช้ตามความเหมาะสม ทั้งนี้แผนภูมิควบคุมมี 2 ชนิดคือ X-Charts ใช้ค่าเฉลี่ยในการสร้างกราฟ เพื่อดูระบบว่ามีความผิดปกติของการวิเคราะห์หรือไม่ และ Range-charts, R หรือ r % ใช้ค่า % RSD ในการสร้างกราฟ เพื่อดูความแม่นยำในการทำซ้ำ ทั้งนี้ คู่มือนี้ขอเสนอหลักการทำแผนภูมิควบคุมแบบ X-charts ที่ห้องปฏิบัติการส่วนมากใช้ โดยหลักการทำแผนภูมิควบคุมเริ่มจากเก็บข้อมูลจากการวิเคราะห์ ไม่น้อยกว่า 20 ค่าที่เป็นอิสระต่อกัน (20 วันหรือมากกว่า) และตรวจสอบ outlier ของข้อมูลด้วย Grubb’s Test ถ้ามีให้ตัดค่านั้นออก แล้วคำนวนใหม่จนกว่าจะได้ 20 ค่าที่ไม่มี outlier พร้อมหาค่า ±SD, ±2SD และ ±3SD หลังจากนั้นสร้างแผนภูมิควบคุมโดยประกอบด้วยข้อมูล ดังนี้

Central line หมายถึง ค่าเฉลี่ยที่ได้จากการวิเคราะห์ (x)
Upper/Lower warning limit หมายถึง x±2SD เป็นค่าเตือน แสดงว่าผลการวิเคราะห์มีความคลาดเคลื่อนใกล้ถึง limit แล้ว
Upper/Lower control limit หรือ action limit คือ x±3SD เป็นค่า limit หากค่าที่ได้เกินค่านี้ต้องหาสาเหตุของความคลาดเคลื่อน

การควบคุมคุณภาพภายนอก (External Quality Control) เป็นการควบคุมคุณภาพผลการวิเคราะห์จากภายนอกเพื่อให้เกิดความมั่นใจในผลการวิเคราะห์ โดยการเปรียบเทียบผลการทดสอบระหว่างห้องปฏิบัติการ ซึ่งเป็นเทคนิคหนึ่งของการประกันคุณภาพสำหรับห้องปฏิบัติการ ทั้งนี้หน่วยงานที่รับผิดชอบที่เป็นผู้จัดโปรแกรมทดสอบความชำนาญ (PT provider) ทำการแจกจ่ายตัวอย่างให้กับห้องปฏิบัติการ เพื่อทำการตรวจวิเคราะห์ ซึ่งทำให้ห้องปฏิบัติการมีเครื่องมือที่เป็นรูปธรรมในการตรวจประเมินและแสดงถึงความน่าเชื่อถือของข้อมูลจากห้องปฏิบัติการ ถือได้ว่ามีความสำคัญต่อห้องปฏิบัติการสำหรับจัดทำระบบคุณภาพห้องปฏิบัติการตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025

1. การร่วม Inter Laboratory Comparison

การประเมินความสามารถและการประเมินผลการทดสอบของห้องปฏิบัติการสองห้องปฏิบัติการหรือมากกว่า ในการวัดตัวอย่างเดียวกัน ภายใต้เงื่อนไขที่กำหนดไว้แล้ว

2. การเข้าร่วมกิจกรรมทดสอบความชำนาญห้องปฏิบัติการ (Proficiency Testing; PT)

การเข้าร่วมการทดสอบระหว่างห้องปฏิบัติการจากหน่วยงานที่ให้บริการทดสอบความชำนาญ โดยห้องปฏิบัติการต้องดำเนินการทดสอบในเวลาเดียวกัน หรือใกล้เคียงกัน ซึ่งตัวอย่างดังกล่าวจะต้องมีความเป็นเนื้อเดียวกัน และมีความเสถียรตลอดช่วงเวลาของการดำเนินกิจกรรม การประเมินค่า ทั้งนี้การประเมินผลการทดสอบ อาศัยเกณฑ์ Z-score ดังนี้

ถ้า | Z | < 2 แสดงว่าผลการทดสอบนั้นยอมรับได้ (Satisfactory)
ถ้า | Z | < 3 แสดงว่าผลการทดสอบนั้นน่าสงสัย (Questionable)
ถ้า | Z | > 3 แสดงว่าผลการทดสอบนั้นยอมรับไม่ได้ (Unsatisfactory)

นอกจากนี้ ห้องปฏิบัติการสามารถดำเนินการเปรียบเทียบผลการทดสอบระหว่างนักวิเคราะห์ภายในหน่วยงานได้ ใช้ในกรณีที่ต้องการเปรียบเทียบผลระหว่างผู้ทดสอบ 2 คนขึ้นไป ทดสอบตัวอย่างเดียวกัน โดยอาจเป็นตัวอย่างที่เคยทดสอบแล้วและมีผลการทดสอบเดิม ทั้งนี้ กรณีทราบค่าจริงหรือมีผลการทดสอบเดิมเปรียบเทียบค่าทดสอบของผู้ทดสอบแต่ละคนกับค่าจริง หรือกับผลการทดสอบเดิม โดยใช้สถิติ t-test แบบ one tail หรือสถิติอื่นที่เหมาะสม

การควบคุมคุณภาพสม่ำเสมอ (routine qaulity control) คือ การควบคุมคุณภาพผลการวิเคราะห์หรือทดสอบในระหว่างกระบวนการวิเคราะห์ให้แน่ใจว่าการทดสอบมีความแม่น ความเที่ยง และมีความน่าเชื่อถือ โดยทั่วไปการควบคุมคุณภาพการทดสอบประกอบด้วยการตรวจสอบแบลงค์ (Blank analysis) การวิเคราะห์สารมาตรฐานสำหรับการตรวจสอบกราฟมาตรฐานความเข้มข้น (Calibration standard curve) การวิเคราะห์ซ้ำ (replicates) การวิเคราะห์การกลับคืนของสารที่ทราบปริมาณ (%recovery) และการทำแผนภูมิควบคุมคุณภาพ (control chart)